使用蛋白質(zhì)沉淀和固相提取技術(shù)制備生物樣品

北京亙辰科技有限公司  Frank Han

介紹

利用LC-MS系統進(jìn)行微小分子的定量分析，需要從血清、血液、尿液、精液、脊髓液和其他離體樣品中去除無(wú)用的生物分子。主要是蛋白質(zhì)，因為蛋白質(zhì)大分子容易變得粘稠并且可能堵塞色譜柱中的小孔。

色譜法

色譜法是生命科學(xué)研究中定量分析的標準分離技術(shù)。蛋白質(zhì)會(huì )破壞液相色譜或氣相色譜，血清中還含有稱(chēng)為磷脂的其他脂肪酸衍生物，也較粘稠且會(huì )堵塞色譜柱。

Porvair Sciences開(kāi)發(fā)出兩種類(lèi)型的96孔板，可從體積高達2ml的血清樣品中去除蛋白質(zhì)，可解決蛋白質(zhì)在色譜柱中的問(wèn)題。96孔P3板或蛋白沉淀板zui簡(jiǎn)單有效、價(jià)格低廉；而C18 SPE板則更先進(jìn)，也更昂貴。

選擇何種孔板和方法取決于樣品，及所需的靈敏度和期望的分析值。

通常，在P3板上制備的樣品適合于標準LC-MS系統檢測，而在C18 SPE板上處理的樣品更適合于毛細管柱的高靈敏度QTOF和LC-MS分析。如果使用質(zhì)譜儀，則會(huì )出現磷脂和蛋白質(zhì)的污染問(wèn)題。

LC-MS

 LC-MS是用于檢查血液或血清樣品中低濃度的類(lèi)藥化合物和代謝物的一種常見(jiàn)技術(shù)。在低濃度時(shí)，磷脂問(wèn)題突出，一組稱(chēng)為溶血磷脂（去除更復雜）可導致檢測到的LC-MS信號的不一致。

離子抑制是由溶血磷脂引起的，其中由這些物質(zhì)誘導的高背景信號掩蓋由分析物產(chǎn)生的實(shí)際信號。離子抑制可以增加和減少分析物信號，使其難以校正。

蛋白沉淀技術(shù)

P3板在蛋白質(zhì)沉淀技術(shù)中能有效去除蛋白質(zhì)，但不能成功去除磷脂和溶血磷脂。使用乙腈或甲醇使蛋白質(zhì)變性。蛋白質(zhì)從溶液中“沉淀”并集結成大的粘性球體，直到使用真空將含有所需分析物的液體推進(jìn)過(guò)濾器，zui后進(jìn)入收集板。

固相萃取

固相萃?。?/span>SPE）是一種傳統技術(shù)，使用P3板需要額外的調節和清潔過(guò)程，耗時(shí)且更難自動(dòng)化。而C18二氧化硅能夠從樣品中去除幾乎所有的磷脂。本文檢測了用于去除磷脂的不同材料的適用性，標準C18硅膠與兩種不同的樹(shù)脂進(jìn)行比較。

評估C18硅膠板去除磷脂

使分析物容易通過(guò)，在吸附劑上保留磷脂。分別用HPLC和比色法測定分析物和磷脂的濃度。陽(yáng)離子交換混合模式樹(shù)脂可用作吸附劑：

樹(shù)脂1

A  PCX樹(shù)脂，混合陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，用于初始測試組。使用磷脂酰膽堿標準物來(lái)評估磷脂的去除。傳統的蛋白質(zhì)沉淀和PCX樹(shù)脂與P3的雜合物的比較，中性，酸性和堿性甲醇作為沉淀溶劑。

結果表明，傳統的蛋白質(zhì)沉淀不能去除任何磷脂，而當與酸性或中性有機溶劑一起使用時(shí)，PCX樹(shù)脂能去除大于90％的磷脂。

樹(shù)脂2

使用酸性，中性和堿改性的有機溶劑檢查PRP X400樹(shù)脂的磷脂保留。

鑒于PRP樹(shù)脂是用磺酸鹽基團改性的二乙烯基苯，其去除磷脂的性能極差。

結果表明，選擇適當地陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，可以很好的去除磷脂。相互作用在約75％有機溶劑產(chǎn)生3:1蛋白質(zhì)沉淀。基于C18二氧化硅足夠的吸附性， P3板有良好的磷脂保留。

初始研究C18的磷脂去除

實(shí)驗1

將600μl的甲醇中混入1mg / ml磷脂酰膽堿并加入到入C18微孔板的孔中，加入200μl蒸餾水，并使用Porvair Sciences的真空歧管在真空下將混合物抽吸通過(guò)C18層。使用Porvair Sciences Miniivap氮氣干燥站收集并蒸發(fā)濾液，然后在600μl chloroform中重構，做磷脂測試。

結果表明，甲醇與水的比例為3：1，可以去除約90％的磷脂。再用acetonitrile代替甲醇進(jìn)行實(shí)驗，結果表明沒(méi)有保留磷脂。選擇合適的板去除磷脂至關(guān)重要。

實(shí)驗2（從豬血漿中除去磷脂）

通過(guò)將200μl血漿注射到600μl甲醇中制備6個(gè)豬血漿樣品。然后將這些樣品離心以除去沉淀的蛋白質(zhì)，并收集上清液。

使用Minivap將所有樣品在氮氣下蒸發(fā)，并在600μl chloroform中重建，用于磷脂檢測。對于兩種C18，磷脂的濃度降至低于10μg/ ml的檢測極限。

實(shí)驗3（分析物回收）

使用三種皮質(zhì)類(lèi)固醇，即潑尼松龍，皮質(zhì)酮和地塞米松，來(lái)評價(jià)分析物的回收率。然后在75％水/甲醇中制備20μg/ ml的皮質(zhì)類(lèi)固醇的溶液。將1ml的分析物溶液通過(guò)C18過(guò)濾，收集濾液并使用HPLC檢查濾液。

結論

上述所有實(shí)驗表明，使用C18樹(shù)脂是去除磷脂的可行方法。典型的3:1甲醇與血漿的沉淀比可除去大部分磷脂，同時(shí)大多數分析物容易通過(guò)。研究表明，C18吸附劑和P3組合可以提供一種合適的去除磷脂的方法，但是需要更多的研究來(lái)確定從這些樣品中去除溶血磷脂。